核酸脂質體納米粒LNP介紹及其制備方法

1. 什麽是核酸脂質體納米粒LNP

脂質體（Liposome）最早在1961年(nián)由科(kē)學(xué)家Alec Douglas. Bangham 和(hé) R. W. Horne在顯微鏡下發現。脂質體是由脂質分子(zǐ)組成的(de)囊泡結構，其脂質雙分子(zǐ)層形成疏水外殼和(hé)內(nèi)部的(de)水相空腔，兼具親水和(hé)疏水特性。脂質納米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）是使用脂質形成納米微粒的(de)一(yī)種。在過去(qù)，科(kē)研人員通常使用脂質納米粒直接包裹化學(xué)藥物，在基因治療領域，研究人員開始使用脂質納米粒包裹核酸，如(rú)mRNA、siRNA、pDNA等，稱為(wèi)核酸脂質納米粒。

針對Covid-19新型冠狀病毒的(de)mRNA疫苗開發，從病毒序列到成功上市(shì)隻用了短(duǎn)短(duǎn)一(yī)年(nián)不到的(de)時間。這在從前是無法想象和(hé)實現的(de)。在這次針對Covid-19新型冠狀病毒的(de)mRNA疫苗上，莫德納(Moderna)采用了自(zì)主開發的(de)可(kě)電離(lí)脂質SM-102，而輝瑞和(hé)BioNTech則從Acuitas公司獲得了一(yī)種名為(wèi)ALC-0315的(de)可(kě)電離(lí)脂質的(de)許可(kě)。

mRNA分子(zǐ)由于疫苗的(de)關系為(wèi)大衆所認識，但是很多人卻不知道(dào)mRNA疫苗的(de)幕後功臣，甚至可(kě)以說是整個機(jī)理(lǐ)的(de)關鍵所在，是将mRNA封裝并且安全有(yǒu)效地(dì)送進機(jī)體細胞的(de)脂質納米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）。從技術上來講，核酸藥物的(de)研發主要有(yǒu)三個壁壘：第一(yī)個是原料端，包括mRNA原料序列的(de)篩選和(hé)修飾；第二個是遞送系統；第三個是整個藥物的(de)生産工藝。目前采用微流控技術産生脂質納米顆粒（LNP）， 将mRNA包裹在LNP 納米顆粒中，再進入人體, 是FDA唯一(yī)批準上市(shì)的(de)mRNA傳遞技術，并且已經在世界各地(dì)注射上億劑的(de)mRNA新冠疫苗中采用，其技術的(de)安全性和(hé)有(yǒu)效性已經在這次全球的(de)新冠疫情中得到驗證。

 

2. 核酸脂質體納米粒LNP的(de)作用機(jī)理(lǐ)

在包裹核酸的(de)脂質納米粒配方中，起關鍵作用的(de)是可(kě)電離(lí)脂質。例如(rú)Onpattro中的(de)Dlin-MC3-DMA（簡稱MC3），其pKa值在6.3-6.5 之間，這個特性讓它在血清的(de)環境中表面電荷基本為(wèi)中性，有(yǒu)利于細胞将帶有(yǒu)核酸片段的(de)脂質納米粒整個吞進細胞內(nèi)，形成胞內(nèi)體（endosome）。 一(yī)旦進入細胞後，胞內(nèi)體的(de)酸性環境使電離(lí)脂質的(de)頭部質子(zǐ)化并帶正電荷，從而與胞內(nèi)體的(de)內(nèi)膜融合，釋放目标核酸到細胞中發揮作用。

 

圖1 核酸脂質體納米粒LNP的(de)作用機(jī)理(lǐ)

 

3. 核酸脂質體納米粒LNP制備方法

最适合的(de)技術還是采用微流控混合技術來制備核酸脂質納米粒，該方法相對簡便快速，條件溫和(hé)，同時容易實現生産放大。微流控技術基本原理(lǐ)：将脂質與核酸分别溶解在水相和(hé)有(yǒu)機(jī)相後，将兩相溶液注入制備系統的(de)兩條入口通道(dào)，一(yī)端是RNA的(de)水溶液，一(yī)端是脂質的(de)乙醇溶液，通過兩相的(de)快速混合，完成核酸脂質納米顆粒的(de)合成。 改變流體注入速度和(hé)比率，可(kě)以控制脂質納米顆粒的(de)粒徑大小。将各種脂質溶解在乙醇中，mRNA溶于酸性水緩沖液中，将兩相快速混合。通過稀釋乙醇相，脂質的(de)溶解度降低(dī)，在混合溶液中逐漸析出凝固并形成脂質納米粒，同時高(gāo)效包載mRNA。再經緩沖液膜包超濾或者透析除去(qù)殘留的(de)乙醇，中和(hé)緩沖液的(de)pH值。

 

4. 制備核酸脂質體納米粒LNP的(de)微流控芯片結構

利用微流控芯片技術制備核酸脂質體納米粒LNP主要是實現充分的(de)混合，常采用魚骨結構。芯片中魚骨結構區域使流經的(de)液體産生混沌流動，大大提高(gāo)了液體的(de)混合效率，比傳統的(de)攪拌混合均一(yī)性好，從而在芯片的(de)出口處快速産生均勻的(de)流體。其中的(de)魚骨結構可(kě)以是凸起（如(rú)圖2所示），也可(kě)以是凹陷（如(rú)圖3所示），制備效果跟體系有(yǒu)關，其粒徑大小主要跟流速比有(yǒu)關。

 

圖2 魚骨結構凸起

圖3 魚骨結構凹陷

 

目前高(gāo)校研究所及部分公司客戶尚處在核酸脂質體納米粒LNP的(de)配方開發階段，常選用帶魚骨結構的(de)PDMS芯片進行(xíng)研究，一(yī)方面是因為(wèi)PDMS材質的(de)芯片加工周期短(duǎn)，成本低(dī)，另一(yī)方面是因為(wèi)PDMS芯片的(de)特性使得實驗參數更易獲得。以下3款核酸脂質體納米粒LNP制備微流控芯片是研究者經常使用的(de)。

 

圖4 ZX-LS-11核酸脂質體納米粒LNP制備芯片（魚骨結構凸起）

圖5 ZX-LS-31核酸脂質體納米粒LNP制備芯片（魚骨結構凹陷）

圖6 ZX-LS-31P核酸脂質體納米粒LNP制備芯片（魚骨結構凹陷）

圖7 魚骨結構核酸脂質體納米粒LNP制備芯片實物圖（PDMS微流控芯片）

 

5. 制備核酸脂質體納米粒LNP的(de)進樣設備

中芯啓恒恒壓泵（壓力驅動微流體進樣儀）用于生成穩定無脈沖的(de)液流，其響應時間短(duǎn)，适用于各種要求苛刻的(de)微流體應用。壓力控制器由計算機(jī)通過 USB 接口控制，使用中芯啓恒 FluidicLab Suite 軟件，可(kě)以生成複雜的(de)壓力或流速曲線 ( 如(rú)正弦波，方波，三角波等 )。配套的(de)中芯啓恒FluidicLab Suite 軟件可(kě)記錄并輸出壓力控制器産生的(de)數據。

 

圖8 中芯啓恒恒壓泵連接示意圖

 

将壓力控制器 1 通道(dào)與 4 mm PU 管一(yī)端連接，然後把連接儲液池的(de) PTFE 管與流量傳感器的(de)“in”接口相連，流量傳感器的(de)另一(yī)端“out”連接 PTFE 管作為(wèi)液體輸出口，最終組裝出設備如(rú)圖1所示。其餘3個通道(dào)的(de)連接與之相同。進樣原理(lǐ)是：以氣推液，氣體管在儲液池頁面以上，出液管在儲液池液面以下，氣體擠壓液面，将液體從出液管擠出，實現進樣操作。

 

5.1 恒壓泵（壓力驅動微流體進樣儀）特點：

壓力輸出波動小于 0.02% ，響應時間 9 ms，無論恒流輸出還是變流 速輸出，均可(kě)應對自(zì)如(rú)。
卓越的(de)性能：
1）內(nèi)置壓力傳感器，高(gāo)速 PID 控制，壓力輸出波動：< 0.02%
2） 響應時間：< 9 ms
3）可(kě)安裝四個獨立的(de)壓力輸出通道(dào) 多種壓力輸出範圍（0-0.2 bar，0-2 bar, 0-8 bar, -1-1 bar, -1-6 bar)，并可(kě)根據客 戶要求定制
4）可(kě)設置恒流輸出（需接流量傳感器）和(hé)壓力波形輸出

 

5.2 壓力控制器軟件的(de)使用：

圖9中芯啓恒恒壓泵壓力控制窗口

 

如(rú)圖9所示，可(kě)以直接設置各通道(dào)的(de)壓力參數，每個通道(dào)的(de)壓力參數可(kě)以設置不同。

 

圖10中芯啓恒恒壓泵壓力控制設置窗口

 

如(rú)圖10所示，用戶可(kě)以設置實時壓力的(de)讀取間隔，其最低(dī)設定值為(wèi) 0.001s ( 實測讀取時最短(duǎn)讀取周期約為(wèi) 0.02 s，低(dī)于此間隔的(de)數據是重複的(de) )。備注信息，壓力校準和(hé)同步增減系數設置（多路壓力協同輸出）也可(kě)以在此操作。

 

6. 制備的(de)核酸脂質體納米粒LNP的(de)粒徑範圍

如(rú)圖11所示，利用帶魚骨結構的(de)微流控芯片制備的(de)核酸脂質體納米粒LNP平均粒徑在142nm左右。

圖11 制備的(de)核酸脂質體納米粒LNP的(de)粒徑範圍