Life Med|脂質納米顆粒靶向遞送mRNA研發策略

湃客：Life Medicine 2022-06-28 07:06

針對近幾年(nián)席卷全球的(de)新型冠狀病毒（COVID-19），疫苗研發一(yī)直是布局重點和(hé)焦點，被寄予厚望。其中，BNT162b（商(shāng)品名Comirnaty）和(hé)mRNA-1273（商(shāng)品名Spikevax）兩款mRNA納米疫苗以其極高(gāo)的(de)保護效率和(hé)研發速度聞名于世，并迅速引發國(guó)內(nèi)外廣泛關注。目前，以mRNA疫苗為(wèi)研究熱點的(de)核酸疫苗被視(shì)為(wèi)是繼（減毒）滅活疫苗、亞單位疫苗之後的(de)第三代新型疫苗，正在引領疫苗研發的(de)潮流，相關産業也正如(rú)火如(rú)荼的(de)進行(xíng)中。“新冠”mRNA疫苗的(de)成功同時推動了全球範圍內(nèi)mRNA的(de)産業化進程。 這些事件的(de)背後實際上是mRNA分子(zǐ)優化、體內(nèi)遞送等底層相關技術取得的(de)長(cháng)足進展，特别是在脂質納米顆粒（LNPs）遞送平台的(de)突破。一(yī)般認為(wèi)，LNPs是遞送mRNA最好的(de)選擇之一(yī)，若要擴寬mRNA的(de)應用場景，研發靶向遞送LNPs技術至關重要。

底層技術的(de)發展加速mRNA應用

自(zì)20世紀60年(nián)代mRNA被發現以來，有(yǒu)關mRNA的(de)應用探索就一(yī)刻也不曾停止。mRNA分子(zǐ)具有(yǒu)不穩定性、免疫原性、無法高(gāo)效進入細胞等特點，在實際應用中非常受限。随着mRNA分子(zǐ)優化技術、遞送技術平台的(de)不斷發展，這些缺點正在慢慢地(dì)被克服。

其一(yī)，mRNA分子(zǐ)優化平台，包括有(yǒu)：1）序列優化的(de)進展，如(rú)5，3端非翻譯區序列的(de)篩選、多聚腺嘌呤（poly A）尾巴的(de)長(cháng)度優化、開放閱讀框（ORF）密碼子(zǐ)的(de)優選等；2）核苷酸化學(xué)修飾的(de)引入，如(rú)5-甲基尿苷和(hé)N1-甲基假尿苷的(de)使用不僅能降低(dī)mRNA的(de)免疫原性，還能提高(gāo)其穩定性；3）制備工藝的(de)提升，如(rú)體外轉錄（IVT）放大工藝的(de)成熟、加帽工序的(de)簡化、純化和(hé)質檢方法的(de)穩定等。其二，遞送載體平台，尤其是LNPs遞送技術的(de)相對成熟。一(yī)般來講，LNPs由四種成分組成，每種成分都扮演着相對重要的(de)角色：可(kě)電離(lí)陽離(lí)子(zǐ)脂質被認為(wèi)是LNPs中最重要的(de)成分，它直接決定了mRNA的(de)包裹效率和(hé)遞送效率；中性輔助磷脂（如(rú)DSPC、DOPE）和(hé)膽固醇脂質有(yǒu)助于提升LNPs的(de)穩定性以及轉染效率；聚乙二醇脂（PEG-Lipid）在調節LNPs尺寸、穩定性、半衰期、遞送效率等方面的(de)作用也十分明顯。值得指出的(de)是，LNPs中單一(yī)成分并非獨自(zì)行(xíng)使功能，各組分之間的(de)配比在mRNA的(de)實際應用中非常重要。

通過多手段研發技術，目前LNPs-mRNA已被應用到多個領域，包括疫苗研發、針對多種重大疾病的(de)蛋白替代療法、基因編輯療法、細胞療法等方面。 

LNPs靶向遞送策略擴寬mRNA應用場景

mRNA精準遞送是保證治療效果的(de)必要條件之一(yī)。針對體表的(de)組織器官（如(rú)肌肉、眼等）可(kě)通過局部給藥方式實現，而體內(nèi)更深層次器官的(de)遞送則選擇靜脈注射更為(wèi)合适。靜脈給藥後LNPs介導的(de)肝髒靶向較容易實現，如(rú)何實現肝外的(de)選擇性遞送則具有(yǒu)挑戰。針對此科(kē)學(xué)問題，研究人員嘗試了多種策略，取得了不錯進展。本亮(liàng)點文章(zhāng)重點總結了近期發表的(de)幾類mRNA靶向遞送策略。

（一(yī)）靶向分子(zǐ)修飾

在LNPs表面進行(xíng)靶向分子(zǐ)修飾是實現細胞靶向遞送最直接的(de)方法。Jonathan A. Epstein教授團隊最近利用CD5抗體修飾包裹了CAR mRNA的(de)LNPs，可(kě)提高(gāo)其體內(nèi)靶向T淋巴細胞的(de)能力。将上述mRNA制劑靜脈注射到心衰小鼠模型後，可(kě)在體內(nèi)對T細胞進行(xíng)重編程，使其形成有(yǒu)功能的(de)CAR-T細胞，可(kě)以靶向過度活躍的(de)心髒成纖維細胞，有(yǒu)效降低(dī)了心髒纖維化，并幫助小鼠恢複了心髒功能。Dan Peer教授團隊通過重組融合蛋白（MadCAM-1-D1D2-Fc）修飾LNPs技術，将mRNA選擇性遞送到特定白細胞亞群，在結腸炎小鼠模型中展現出了潛在的(de)治療前景。不同于抗體修飾，Gabriel A. Kwong課題組最近開發了一(yī)種光控的(de)多肽配體置換平台，可(kě)快速變換修飾到LNPs表面的(de)靶向抗原多肽，在體內(nèi)實現對多種抗原特異性T細胞群的(de)靶向mRNA遞送。以上修飾技術可(kě)顯著增強對特定細胞類型的(de)靶向遞送能力，但在特異性方面略顯不足。

（二）高(gāo)通量篩選

上文提到，可(kě)離(lí)子(zǐ)化陽離(lí)子(zǐ)脂質是LNPs中最重要的(de)成分。通過結構各異的(de)化學(xué)結構庫進行(xíng)高(gāo)通量篩選早已被證實是研發靶向LNPs最為(wèi)有(yǒu)效的(de)方法之一(yī)，目前大多數LNPs是由此技術研發産生的(de)，可(kě)實現肝、肺、脾、腦等器官的(de)mRNA遞送,但此方法相對盲目、工作量大。James Dahlman課題組結合“DNA條形碼”和(hé)深度測序技術，開發了一(yī)種新型的(de)高(gāo)通量篩選技術，簡稱為(wèi)FIND，可(kě)顯著提升LNPs的(de)篩選效率。他們(men)将Cre mRNA和(hé)特定序列的(de)DNA條形碼包裹到同一(yī)個LNPs中，隻需設計不同的(de)DNA條形碼就可(kě)制備出帶有(yǒu)特定“标簽”的(de)一(yī)系列LNPs-mRNA藥物。将這些“标簽”各異的(de)LNPs通過靜脈一(yī)起注射到Cre誘導表達tdTom的(de)轉基因小鼠中，利用流式細胞儀檢測tdTom陽性細胞，并結合DNA深度測序的(de)方法可(kě)鑒别出特定細胞靶向的(de)LNPs載體。通過該體系，他們(men)可(kě)同步篩選超200種LNPs，顯著提高(gāo)了LNPs的(de)篩選效率。

（三）可(kě)預測性LNPs優化

區别于高(gāo)通量篩選，如(rú)果給出明确的(de)LNPs設計原則，則會大大縮短(duǎn)研發周期，提高(gāo)研發效率。Daniel Siegwart課題組2020年(nián)在Nature Nanotechnology上報道(dào)了一(yī)種可(kě)預測性設計的(de)LNPs研發技術，命名為(wèi)SORT。在原有(yǒu)4組分LNPs基礎上，僅添加一(yī)種帶有(yǒu)不同電荷的(de)新脂質分子(zǐ)（SORT分子(zǐ)），則可(kě)實現mRNA在小鼠的(de)肝髒、脾髒、肺部的(de)靶向遞送和(hé)基因編輯。通過增加陽離(lí)子(zǐ)脂質能夠使mRNA特異遞送進入肺部；陰離(lí)子(zǐ)脂質能夠使mRNA特異進入脾髒；而可(kě)離(lí)子(zǐ)化陽離(lí)子(zǐ)脂質則會增強肝髒的(de)靶向遞送。重要的(de)是，SORT技術具有(yǒu)普适性，可(kě)在多種類型的(de)LNPs基礎上快速研發出肝外器官靶向LNPs。進一(yī)步機(jī)制探究發現，SORT分子(zǐ)可(kě)調控SORT-LNPs在器官水平的(de)生物分布、LNPs自(zì)身pka、及表面血清蛋白冠等，這些因素最終決定了LNPs在體內(nèi)的(de)靶向遞送能力。文中指出，在器官靶向遞送方面，LNPs表面的(de)血清蛋白冠起到最關鍵作用，識别這些獨特的(de)蛋白質可(kě)能會在未來研發靶向其他器官的(de)LNPs方面有(yǒu)所幫助。

圖1. 體內(nèi)靶向遞送mRNA-LNPs的(de)研發策略。

總結與展望
器官選擇性遞送對于拓寬mRNA臨床應用至關重要。本文提到的(de)幾種代表性策略在一(yī)定程度上提出了解決方案，但各有(yǒu)不足之處。如(rú)何開發出靶向其他重要器官（如(rú)心髒、胰腺、腎髒）的(de)LNPs、如(rú)何實現對特定髒器中特定細胞類型的(de)靶向遞送都是未來需要解決的(de)重要問題。随着研究人員對mRNA靶向遞送技術的(de)深入研究，相信未來會有(yǒu)更多的(de)靶向遞送策略研發出來用于精準醫療研究。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac004